
蛋白質分離純化步驟(二) 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質的酸堿性質作為分離的基礎。離子交換纖維素(cellulose ion-exchanger)是人工合成的纖維素衍生物,它具有松散的親水性網狀結構,有較大的表面積,使蛋白質大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質的分離。 (1)羧甲基纖維素(CM-纖維素) 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下,羧甲基上的質子可解離下來(圖2-27a),而溶液中帶正電荷的蛋白質分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結合,北京智能蛋白純化系統上門安裝。可交換的基團帶正電,因此是一種陽離子交換劑,北京智能蛋白純化系統上門安裝。蛋白質與離子交換纖維素之間結合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。 (2)二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素) 在中性pH條件下,它含有帶正電荷的基團,可與溶液中的帶負電荷的蛋白質結合,可交換的基團帶負電荷,因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時,帶正電荷的蛋白質不能結合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質將被結合到柱上。結合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引,北京智能蛋白純化系統上門安裝。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫,改變蛋白質分子所帶的靜電荷,依次從層析柱流出達到相互分離的目的。
三、蛋白質分子量的測定 蛋白質分子量測定的方法很多,目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過濾法 凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理如“分離純化方法”中所 述。一定型號的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙,只允許較小的分子進入膠粒,而大于孔隙的分子則不能進入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時,被排阻的分子量大的蛋白質先被洗脫下來,隨后能夠進入顆粒的蛋白質也按分子量大小而先后被洗脫下來,分子量越小的越后被洗脫下來。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍,在此范圍內,分子量的對數和洗脫體積之間成線性關系。因此,用幾種已知分子量的蛋白質為標準進行層析分析,以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數作圖,繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行層析分析,根據其所用的洗脫體積,從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量來。
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