關鍵詞:總RNA提取服務|實驗技術服務

簡介：世界良好品牌總RNA提取服務|實驗技術服務原裝正品，質量**,價格優惠。

總RNA提取服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。

我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧，承諾客戶*。我們所有的實驗數據真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。

產品品牌：總RNA提取服務|實驗技術服務?

測序實驗流程：

（一）細胞總RNA的提取

1、6孔板細胞匯合度為90-**時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑 1 ml，搖勻，無菌罩內消化3-5 min。

2、將各孔內消化好的細胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管中，加新開的0.2 ml，輕搖15 s。

3、室溫靜置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，離心。然后取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過），加0.5 ml新開的，室溫下靜置10 min。

4、12000 rpm，10 min，4 ℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清，75%1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃離心。

5、去上清，點離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10 min， DEPC處理水20-30 μl加入，中槍打勻，55-60 ℃水浴10 min溶解總RNA，測OD值。

6、電泳。

（二）從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）

1、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個新的無RNase 的EP管中，用無RNase的水定容到250 μl。

2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打勻或用手彈勻。

3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二級結構）。

4、20-30℃條件下，靜置10 min（讓Oligotex與mRNA結合）。

5、高速離心2 min，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 μl的上清在原管里。

6、用Buffer OW2 400 μl重懸含Oligotex/mRNA復合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1 min。

7、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速離心1 min，丟掉濾過液。

8、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100 μl熱的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip來回吸打3-4 次，高速離心1 min。

10、電泳。

9、為**較大的 mRNA產量，可再次重復第8步。

1. 六孔板每孔細胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，槍頭吹打。

2. ?將各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入0.2ml/管，用力振搖15s。15－30℃下孵育2-3min，離心（4℃，12,000g，15min）。

3. ?離心后液體分為三層（上層－無色水樣層為RNA，中層白色為DNA和底層紅色為蛋白質），小心吸取上層無色液體移入一新的EP管中。

4. 加入等體積，0.4－0.5ml，混勻，15-30℃下孵育10－30min，離心（4℃，12，000g，10min）。其中如果加入等體積后，置于試管架上用PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。

5. 去上清，沉淀加入75％1ml，漩渦振蕩30s，離心（4℃，7,500g，5min）。

6. ?小心去上清，管內沉淀在**凈臺中鼓風靜置干燥3-5min。較好是用槍頭吸取上清，盡量除去。

7. 加入20ul DEPC水溶解，分裝5ul/管，-70℃冰箱保存。

8. 細胞總RNA的鑒定：0.9-1.2％瓊脂糖電泳鑒定細胞總RNA，觀察出現條帶及各條帶亮度。紫外分光光度計測定：分別測定細胞總RNA在260nm和280nm處的光密度值(OD)，并計算RNA的含量和純度。

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