標記肽段回交的抑制

18O標記反應的另一個常見問題是標記肽段容易發生回交。由于該標記反應是一種可逆反應，因此如果將18O標記完全的肽段溶于H216O中，仍能使18O標記肽段回復到16O標記狀態。胰酶是造成回交的主要因素，穩定同位素標記，目前文獻報道抑制回交的方法有酸中止法、超濾胰酶法和微波胰酶滅活法，都不能完全抑制胰酶的活性，穩定同位素法，置于H216O中仍能發生一定程度的回交。有研究采用化學滅活法，通過高濃度的還原試劑和烷ji化試劑，對溶液中殘留的胰酶徹底滅活。胰酶滅活后，18O標記肽段在液相色譜流動相（2%yi腈-98%水-0.5%）中保存6d仍沒有觀察到明顯的回交產物，穩定的標記肽段能在液相色譜中進行后續分離分析。

增強蛋白質酶切肽段的標記效率蛋白質酶切肽段18O標記方法的原理是基于胰蛋白酶催化產生的兩次酶-肽段復合物水解反應。該反應是快速的動態可逆反應。因此，經常發生標記效率不完全和標記肽段發生回交的情況，穩定同位素結果分析，有效地控制標記和回交抑制這兩個環節是實驗成功的關鍵。有實驗通過改善肽段在反應體系中的分散程度和輔助加熱，增加反應效率來有效地提高標記效率。肽段在體系中的分散程度增高后，有利于肽段C端的完全暴露，增加與胰酶和H218O的接觸機會。因此，改善肽段分散程度，能推進標記向正反應方向進行。在實驗中，加入RapigestTMSF助溶劑，能增強蛋白質及多肽的溶解性，提高分散程度，利于H218O進行C末端羧基的交換反應。在α-酪蛋白酶切肽段18O標記產物質譜分析結果中，因為加入RapigestTMSF助溶劑，m/z1660，1267和2316的肽段的標記效率明顯提高（圖1A和圖1D）。而未加入助溶劑組的3個肽段則標記不完全，仍然存在大量未標記的16O肽段。常規方法中，18O標記需要在37℃水浴中孵育24h，以達到充分反應的目的。但即便如此，溫和的反應條件和較長的反應時間也難以**標記完全。蛋白質酶切加上標記所耗費的時間**過36h，滯后了實驗的進程。并且由于長時間置于水浴環境，容易因為密封不嚴等情況引入H216O，穩定同位素，從而導致標記不完全。本實驗采用微波加熱的方式，不僅隔絕了潮濕的環境，而且只需要10min即可標記完全。與傳統的水浴加熱方法相比，由于微波使肽段的受熱更為快速和均勻，因此能在很短時間內達到理想的標記效果。

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